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2014/12/08

食品法規導讀--食品微生物之檢驗方法-乳酸菌之檢驗 (101.06.07)



公發布日:101.06.07
文  號:署授食字第1011902050號
發布機關:行政院衛生署
法規名稱:食品微生物之檢驗方法-乳酸菌之檢驗
摘  要:行政院衛生署公告:訂定「食品微生物之檢驗方法-乳酸菌之檢驗」為食品衛生管理法所定之食品衛生檢驗方法,自即日生效
資料來源:行政院公報   (點擊連結另開視窗查閱內容)



下列,使用底色強調原條文的重點,個人加註的筆記使用非黑色字。





主  旨:訂定「食品微生物之檢驗方法-乳酸菌之檢驗」,為食品衛生管理法所定之食品衛生檢驗方法,並自即日生效。
依  據:食品衛生管理法第二十五條。
署  長 邱文達
     本案依分層負責規定授權局長決行
 
食品微生物之檢驗方法-乳酸菌之檢驗
10167日署授食字第1011902050號公告
1. 適用範圍:本方法適用於食品中乳酸菌之檢驗。
2. 檢驗方法:檢體經系列稀釋後,以選擇性培養基培養及計數之方法。
2.1. 工作環境:工作平台須寬敞、潔淨、光線良好,操作平台光度為100呎燭光以上,密閉室內換氣良好,儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過 15 C FU/培養皿。{阿原在實驗室測過,落菌數沒有超標}
2.2. 器具及材料
2.2.1.  乾熱滅菌器。
2.2.2.  高壓滅菌釜。
2.2.3.  冰箱:能維持5 ± 3℃ 者。
2.2.4.  培養箱:能維持內部溫度溫差 ± 1.0℃ 以內者。
2.2.5.  水浴:能維持水溫溫差 ± 1.0℃ 以內者。
2.2.6.  攪拌均質器(Blender)或鐵胃(Stomacher):能適用於無菌操作者。
2.2.7.  天平:可稱量到 2000 g ,靈敏度為 0.1 g ;可稱量到 120 g ,靈敏度為5 mg
2.2.8.  旋渦混合器(Vortex mixer)。
2.2.9.  酸鹼度測定儀(pH meter)。
2.2.10. 菌落計數器:適用於菌落之計算者。
2.2.11. 厭氧缸(Anaerobic jar)或厭氧培養箱:適用於厭氧培養者。
2.2.12. 吸管輔助器(Pipette aid)。
2.2.13. 吸管(Pipette):已滅菌。 1 m L吸管應有 0.01 m L之刻度; 5 m L 10 m L吸管應有 0.1 m L刻度。
2.2.14. 培養皿:已滅菌,內徑約 90 mm ,深度約 15 mm ,底皿之內外面應平坦,無氣泡、刮痕或其他缺點。
2.2.15. 稀釋用容器:無菌袋或有1000 mL500 mL 99 m L 90 m L標記附蓋(栓)之可滅菌廣口瓶。
2.2.16. 藥勺、剪刀、小刀、壓舌板及鑷子:可滅菌或可拋棄式者。
2.2.17pH試紙:範圍6-8
2.2.18. 無菌濾膜:孔徑0.2 μm或以下之親水性醋酸纖維濾膜。
2.2.19. 試藥:葡萄糖(dextrose)、聚山梨醇酯80polysorbate 80, Tween 80)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、醋酸鈉(sodium acetate)、檸檬酸銨(ammonium citrate)、硫酸鎂(MgSO47H2O)、硫酸錳(MnSO44H2O)、碳酸鈣、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸銨((NH4)2SO4)、L-半胱胺酸鹽(L-cysteineHClH2O)、丙酸鈉(sodium propionate)、轉半乳糖苷寡醣(transgalactosylated oligosaccharides, TOS)、疊氮化鈉(sodium azide)、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride, TTC)及莫匹羅星鋰(lithium mupirocin)均採用化學試藥級;蛋白腖(peptone)、牛肉抽出物(beef extract)、酵母抽出物(yeast extract)、胰蛋白腖(tryptose)及洋菜均採用微生物級。
2.2.200.1%蛋白腖稀釋液(0.1% peptone diluent)之配製:取蛋白腖 1 g 溶於蒸餾水,使成1000 mL,分裝於稀釋用容器中,經 121 滅菌15分鐘,最終pH值為7.0 ± 0.1
2.2.21. 培養基(註)
2.2.21.1MRS培養基(MRS agar, MRSA {MRS有現成商品,不需要自己配置}
     蛋白腖(peptone                                                                                        10 g
     牛肉抽出物(beef extract                                                                          10 g
     酵母抽出物(yeast extract                                                                          5 g
     葡萄糖(dextrose                                                                                       20 g
     聚山梨醇酯80polysorbate 80, Tween 80                                                 1 g
     磷酸氫二鉀(K2HPO4                                                                                2 g
     醋酸鈉(sodium acetate{抑制非乳酸菌}                                                    5 g
     檸檬酸銨(ammonium citrate   {抑制非乳酸菌}                                   2 g
     硫酸鎂(MgSO47H2O                                                                          0.1 g
     硫酸錳(MnSO44H2O                                                                        0.05 g
     洋菜(agar                                                                                                  15 g
     蒸餾水                                                                                                       1000 m L
                   加熱溶解後,以 121 滅菌15分鐘,最終pH值為6.5 ± 0.2
                      若需添加碳酸鈣,則稱取碳酸鈣 5 g ,預先以 180 乾熱滅菌12小時,加入上述培養基中,以 121 滅菌15分鐘,最終pH值為6.5 ± 0.2
2.2.21.2轉半乳糖苷寡醣-莫匹羅星培養基(Transgalactosylated oligosaccharides-mupirocin medium, TOS-MUP
               基礎培養基(Basic medium):轉半乳糖苷寡醣-丙酸鹽培養基(TOS-propionate agar medium
     蛋白腖(peptone                                                                                         10 g
     酵母抽出物(yeast extract                                                                           1 g
     磷酸二氫鉀(KH2PO4                                                                                3 g
     磷酸氫二鉀(K2HPO4                                                                              4.8 g
     硫酸銨((NH4)2SO4                                                                                     3 g
     硫酸鎂(MgSO47H2O                                                                           0.2 g
     L-半胱氨酸鹽(L-cysteineHClH2O                                                 0.5 g
     丙酸鈉(sodium propionate                                                                        15 g
     轉半乳糖苷寡醣(transgalactosylated oligosaccharides, TOS                  10 g
     洋菜(agar                                                                                                   15 g
     蒸餾水                                                                                                         950 mL
                     攪拌加熱溶解後,每瓶分裝190 mL,以 115 滅菌15分鐘,最終pH值為6.3 ± 0.2。配製好之基礎培養基置於2 4 冷藏條件下,可儲存1週。
               莫匹羅星補充溶液(MUP supplement solution
                     稱取莫匹羅星鋰(lithium mupirocin50 mg溶於蒸餾水50 mL,以無菌膜過濾,臨用時配製。
               完全培養基(Complete medium
                     取配製好之基礎培養基,加熱溶解冷卻至48 ± 1,每 190 m L加入莫匹羅星補充溶液10 mL(最終濃度為50 mg/L),小心混勻避免氣泡產生,冷卻至約 48 使用。
2.2.21.3. 腸球菌培養基(Enterococcus agar
     胰蛋白腖(tryptose                                                                                      20 g
     酵母抽出物(yeast extract                                                                             5 g
     葡萄糖(dextrose                                                                                            2 g
     磷酸氫二鉀(K2HPO4                                                                                  4 g
     疊氮化鈉(sodium azide                                                                             0.4 g
     2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride, TTC)       0.1g
     洋菜(agar                                                                                                    10 g
     蒸餾水                                                                                                       1000 mL
                 加熱沸騰1分鐘,使培養基完全溶解,最終pH值為7.2 ± 0.2
 註:1本方法之MRS培養基適用於總乳酸菌之計數;轉半乳糖苷寡醣-莫匹羅星培養基適用於雙叉桿菌之計數;腸球菌培養基適用於腸球菌之計數。
   2. 特殊營養需求之菌株,可依其菌株特性探討適合之培養基。
   3. 計數複合菌株時,若採用多種培養基,應排除重複計數之可能。
2.3. 檢液之調製:
2.3.1.  固態檢體:將檢體切碎混合均勻後,取 50 g ,加入0.1%蛋白腖稀釋液450 mL,混合均勻,作為10倍稀釋檢液。
2.3.2.  粉狀、粒狀或其他易於粉碎之檢體:以已滅菌之藥勺或其他用具將檢體粉碎後,混合均勻,取 50 g ,以下步驟同2.3.1 .節之操作。
2.3.3.  液態檢體:將檢體振搖均勻混合,取 50 m L,作為原液,以下步驟同 2.3.1 .節之操作。
2.3.4.  冷凍檢體:須解凍者,如冷凍魚、禽畜肉、蔬果、水餃等,應在冷藏之溫度下解凍(如2 5 ,18小時內即可解凍完全);亦可使用較高溫度快速解凍(置於 45 以下之水浴中,可在15分鐘內解凍之檢體適用之)。解凍時應經常搖動檢體,以加速解凍。解凍後,再予以切碎並混合均勻。不須解凍者,如食用冰塊、冰棒等冰類製品,應速先行使成適當小塊;再依照 2.3.1 .節方法,製成10倍稀釋檢液。如檢驗工作無法立即進行,應將檢體貯存於 -20 。
2.3.5.  凝態及濃稠液態檢體:如布丁、煉乳、海苔醬等檢體,經攪拌均勻後,取 50 g ,以下步驟同 2.3.1 .節之操作。
2.3.6.  系列稀釋檢液:使用已滅菌之吸管,吸取上述之10倍稀釋檢液10 mL,加至0.1%蛋白腖稀釋液 90 m L中,依序作成100倍、1000倍、10000倍等一系列稀釋檢液,其稀釋方法如下圖所示。
 
2.4. 乳酸菌之培養:
2.4.1.  2.3.節之稀釋檢液及(或)原液充分振搖,混合均勻。
2.4.2.  吸取各稀釋檢液及(或)原液1 mL,分別置入培養皿中,各檢液至少作二重複。
2.4.3.  2.4.2 .節之各培養皿,分別倒入43 45 之培養基1520 mL,搖動混合。
2.4.4.   2.4.3 .節之培養基平板靜置,待培養基凝固後,置於35 37 厭氧培養72 ± 3小時,腸球菌之培養則採好氧培養2448小時。
2.5. 乳酸菌之計算:
2.5.1.  觀察菌落之生長狀態,添加碳酸鈣於MRS培養基中,使其濃度為0.5%,為選擇性培養基 {會抑制多數細菌,但是不會抑制真菌},乳酸菌菌落會產生透明環;TOS-MUP培養基中,典型雙叉桿菌為白色菌落,直徑約1 4 mm ;腸球菌培養基中,腸球菌為紅色菌落。
2.5.2.  菌數之計數:選取25250個菌落之平板進行計數,其菌數之表示方式為CFU/gCFU/mL,記錄菌數時應將該數字第三位數字四捨六入(當第三位數字為五時,遇第二位數字為奇數時進位,偶數時捨去),使其有效數為兩位。
2.6. 檢驗流程圖