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2014/12/08

食品法規導讀-生菌數之檢驗 (101.11.19)




公發布日:101.11.19
文  號:署授食字第1011902832號
發布機關:行政院衛生署
法規名稱:食品微生物之檢驗方法-生菌數之檢驗
摘  要:行政院衛生署公告:訂定「食品微生物之檢驗方法-生菌數之檢驗」,自即日生效
資料來源:行政院公報   (點擊連結另開視窗查閱內容)




行政院衛生署公告中華民國1011119
署授食字第1011902832號
主  旨:訂定「食品微生物之檢驗方法-生菌數之檢驗」,並自即日生效。
依  據:食品衛生管理法第二十五條。
署  長 邱文達
     本案依分層負責規定授權局長決行
 
食品微生物之檢驗方法-生菌數之檢驗
1011119日署授食字第1011902832號公告
1. 適用範圍:本方法適用於食品中生菌數之檢驗。
2. 檢驗方法:檢體經系列稀釋後,以平板計數培養基培養及計數之方法。
2.1. 工作環境:工作平台須寬敞、潔淨、光線良好,操作平台光度為100呎燭光以上,密閉室內換氣良好,儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過 15 C FU/培養皿。
2.2. 器具及材料
2.2.1.  乾熱滅菌器。
2.2.2.  高壓滅菌釜。
2.2.3.  冰箱:能維持5 ± 3℃ 者。
2.2.4.  培養箱:能維持內部溫度溫差 ± 1.0℃ 以內者。
2.2.5.  水浴:能維持水溫溫差 ± 1.0℃ 以內者。
2.2.6.  攪拌均質器(Blender)或鐵胃(Stomacher):能適用於無菌操作者。
2.2.7.  天平:可稱量到 2000 g ,靈敏度為 0.1 g ;可稱量到 120 g ,靈敏度為5 mg
2.2.8.  旋渦混合器(Vortex mixer)。
2.2.9.  酸鹼度測定儀(pH meter)。
2.2.10. 菌落計數器:適用於菌落之計算者。
2.2.11. 吸管輔助器(Pipette aid)。
2.2.12. 吸管(Pipette):已滅菌。 1 m L吸管應有 0.01 m L之刻度; 5 m L 10 m L吸管應有 0.1 m L刻度。
2.2.13. 培養皿:已滅菌,內徑約 90 mm ,深度約 15 mm ,底皿之內外面應平坦,無氣泡、刮痕或其他缺點。
2.2.14. 稀釋用容器:無菌袋或有1000 mL500 mL 99 m L 90 m L標記附蓋(栓)之可滅菌廣口瓶。
2.2.15. 藥勺、剪刀、小刀、壓舌板及鑷子:可滅菌或可拋棄式者。
2.2.16. pH試紙:範圍6-8
2.2.17. 試藥:氯化鈉、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氫氧化鈉、葡萄糖(glucose)及油酸聚醇山梨酯(polysorbate 80,Tween 80)均採用試藥級;蛋白腖(peptone)、胰化蛋白腖(tryptone)、酵母抽出物(yeast extract)及洋菜(agar)均採用微生物級。
2.2.18. 1N氫氧化鈉溶液之配製:
               稱取氫氧化鈉 4 g ,加入無菌水溶解使成100 mL
2.2.19. 稀釋液之配製:
2.2.19.1. 生理食鹽水
                 取氯化鈉8.5 g,溶於蒸餾水 1000 m L中,分裝於稀釋用容器中,經 121 滅菌15分鐘。
2.2.19.2. 磷酸鹽緩衝液Butterfield's phosphate-buffered dilution water):
                     取磷酸二氫鉀 34 g ,溶於蒸餾水500 mL,以1N氫氧化鈉溶液調整pH值為7.2,再加蒸餾水使成1000 mL,以 121 滅菌15分鐘,貯存於冰箱中,作為原液。使用時,取原液1.25 mL,加入蒸餾水使成1000 mL,分裝於稀釋用容器中,以 121 滅菌15分鐘。
2.2.19.3. 0.1%蛋白腖稀釋液0.1% peptone diluent):
                 取蛋白腖 1 g ,溶於蒸餾水使成1000 mL,分裝於稀釋用容器中,經 121 滅菌15分鐘,最終pH值為7.0 ± 0.1
2.2.20. 平板計數培養基Plate count agar, PCA),亦稱標準方法培養基(Standard method agar
              胰化蛋白腖(tryptone........................................................................................ 5 g
              酵母抽出物(yeast extract.............................................................................. 2.5 g
              葡萄糖(glucose................................................................................................. 1 g
              洋菜(agar........................................................................................................ 15 g
             蒸餾水.............................................................................................................. 1000 mL
             加熱溶解後,分裝於適當之容器中,經 121 滅菌15分鐘,最後pH值為7.0 ± 0.2
2.3. 檢液之調製
2.3.1.  固態檢體:將檢體切碎混合均勻後,取 50 g ,加入稀釋液450 mL,混合均勻,作為10倍稀釋檢液。
2.3.2.  粉狀、粒狀或其他易於粉碎之檢體:以已滅菌之藥勺或其他用具將檢體粉碎後,混合均勻,取 50 g ,以下步驟同2.3.1 .節之操作。
2.3.3.  液態檢體:將檢體振搖均勻混合,取 50 m L,作為原液,以下步驟同 2.3.1 .節之操作。
2.3.4.  冷凍檢體:須解凍者,如冷凍魚、禽畜肉、蔬果、水餃等,應在冷藏之溫度下解凍(如2 5 ,18小時內即可解凍完全);亦可使用較高溫度快速解凍(置於 45 以下之水浴中,可在15分鐘內解凍之檢體適用之)。解凍時應經常搖動檢體,以加速解凍。俟檢體解凍後,再予以切碎並混合均勻。不須解凍者,如食用冰塊、冰棒等冰類製品,應速先行使成適當小塊;再依 2.3.1 .節,製成10倍稀釋檢液。如檢驗工作無法立即進行,應將檢體貯存於 -20 。
2.3.5.  凝態及濃稠液態檢體:如布丁、煉乳、海苔醬等,經攪拌均勻後,取 50 g ,以下步驟同 2.3.1 .節之操作。
2.3.6. 系列稀釋檢液:使用已滅菌之吸管,吸取上述之10倍稀釋檢液 10 m L加至稀釋液 90 m L中,依序作成100倍、1000倍、10000倍等一系列稀釋檢液,其稀釋方法如下圖所示
           
 
註:1. 除肉製品使用0.1%蛋白腖稀釋液外,其他檢體以磷酸鹽緩衝液作為稀釋液,其次為生理食鹽水。
  2. 檢體總量不足50 gmL)時,應依檢體量,添加適量之稀釋液,作成10倍稀釋檢液。
  3. 處理含油脂量多,不易勻散及易起泡沫之檢體時,應加入適量已滅菌之乳化劑(如Tween 80,使其於檢液中濃度為1%),並充分振搖,使之乳化。
2.4. 生菌之培養
2.4.1.  將稀釋檢液及(或)原液充分振搖,混合均勻。
2.4.2.  各吸取各稀釋檢液及(或)原液 1 m L分別置入培養皿中,各檢液至少做二重複。
2.4.3.  另吸取稀釋液 1 m L置入培養皿中,作為空白對照組(二重複)。
2.4.4.  2.4.2.節及2.4.3.節之各培養皿中倒入冷卻至45 ± 1℃ 之平板計數培養基PCA1215 mL,搖動混合,自檢液之調製至此步驟應於15分鐘內完成。
2.4.5.   2.4.4 .節之培養基平板靜置,待培養基凝固後,倒置於 35 培養48 ± 2小時
2.5. 生菌之計算
2.5.1.  經培養後,選取25250個菌落之兩個平板來計數,其生菌數之表示方式為CFU/gCFU/mL
2.5.2.  若各稀釋倍數中僅有一種稀釋倍數平板之菌落數為25250,則應以該稀釋倍數之兩個平板之菌落數平均值乘其稀釋倍數,即得其生菌數(附表:樣品編號1);但若有兩種稀釋倍數之平板之菌落數在25250個之間時,則應依下列公式計算之,但生菌數結果表示時應將該數字第三位數字四捨六入當第三位數字為五時,遇第二位數字為奇數時進位,偶數時捨去),使其有效數為兩位。(附表:樣品編號2)。
               生菌數CFU/gCFU/mL 
             AaAbA稀釋倍數各平板內之菌落數。
             BaBbB稀釋倍數各平板內之菌落數。
             AB:稀釋倍數。
2.5.3.  各稀釋倍數之菌落數均小於25個時,則以最低稀釋倍數之兩個平板菌落數平均值乘其稀釋倍數。並註明其為估計值(附表:樣品編號3)。
2.5.4.  平板中菌落數大於250時,則先計數平板中菌落分佈其代表性之一部份,再計算生菌數,而以估計值表示(附表:樣品編號4)。
2.5.5.  擴散菌落,擴散菌落可分為3種形式:
  (1)   鏈狀菌落,不能明顯分離,似乎由一堆細菌分裂生長而成。
  (2)   細菌生長介於培養基及培養皿底部間之一層水氣中。
  (3)   細菌生長於培養基邊緣或表面上之一層水氣上。
2.5.5.1.   平板內產生擴散菌落時應以下述之方法計數。(附表:樣品編號5)擴散菌落所覆蓋面積(包括被擴散菌落造成之抑制生長範圍)超過整個平板面積之1/2時或者被擴散菌落造成之抑制生長範圍超過1/4時,應不予計數,而記錄為’’擴散菌落’’
2.5.5.2.   擴散菌落形成鏈狀時,若僅一條則應視為一個菌落,若有兩條以上存在時,應視其鏈源處之不同,分別計數之。若為彼此分開而形成大菌落時,亦應予以計數。
2.5.6.  各稀釋倍數均無菌落生長者,則生菌數應小於1乘以最低稀釋倍數並註明估計值(附表:樣品編號6)。
2.5.7.  若二重複平板之菌落數,其中一片在25250個之間,另一片大於250個時,兩者均應計數(附表:樣品編號7)。
2.5.8.  若二稀釋倍數之菌落數,各有一片在25250個之間,另一片大於250個或小於25個時,四片皆計數,並依 2.5.2 .節公式計算之(附表:樣品編號8)。
2.5.9.  當二稀釋倍數之菌落數,其中1稀釋倍數之2重複平板之菌落數均在25250之間,另1稀釋倍數之2重複平板之菌落數,一片在25250之間,另一片大於250個或小於25個時,四片皆計數,並依公式計算之(附表:樣品編號910)。
2.5.10. 確證被污染者或依其他理由認為不適當者,應不得計算之。
 
                                                       附表 生菌數計算舉例說明(2平板/稀釋倍數)
 
2.6. 檢驗流程圖
                                         
 
2.7. 可參考使用經確效認可之市售培養基、生化檢測套組或鑑定系統,惟檢驗結果有爭議時,應以本檢驗方法為準。