| 公發布日： | 101.11.19 |
|---|---|
| 文 號： | 署授食字第1011902832號 |
| 發布機關： | 行政院衛生署 |
| 法規名稱： | 食品微生物之檢驗方法－生菌數之檢驗 |
| 摘 要： | 行政院衛生署公告：訂定「食品微生物之檢驗方法－生菌數之檢驗」，自即日生效 |
| 資料來源： | 行政院公報 (點擊連結另開視窗查閱內容) |
| 行政院衛生署公告 | 中華民國101年11月19日 署授食字第1011902832號 |
主 旨：訂定「食品微生物之檢驗方法－生菌數之檢驗」，並自即日生效。
依 據：食品衛生管理法第二十五條。
署 長 邱文達
本案依分層負責規定授權局長決行
食品微生物之檢驗方法－生菌數之檢驗
101年11月19日署授食字第1011902832號公告
1. 適用範圍：本方法適用於食品中生菌數之檢驗。
2. 檢驗方法：檢體經系列稀釋後，以平板計數培養基培養及計數之方法。
2.1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過
2.2. 器具及材料
2.2.1. 乾熱滅菌器。
2.2.2. 高壓滅菌釜。
2.2.3. 冰箱：能維持5 ±
2.2.4. 培養箱：能維持內部溫度溫差 ±
2.2.5. 水浴：能維持水溫溫差 ±
2.2.6. 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）：能適用於無菌操作者。
2.2.7. 天平：可稱量到
2.2.8. 旋渦混合器（Vortex mixer）。
2.2.9. 酸鹼度測定儀（pH meter）。
2.2.10. 菌落計數器：適用於菌落之計算者。
2.2.11. 吸管輔助器（Pipette aid）。
2.2.12. 吸管（Pipette）：已滅菌。
2.2.13. 培養皿：已滅菌，內徑約
2.2.14. 稀釋用容器：無菌袋或有1000 mL、500 mL、
2.2.15. 藥勺、剪刀、小刀、壓舌板及鑷子：可滅菌或可拋棄式者。
2.2.16. pH試紙：範圍6-8。
2.2.17. 試藥：氯化鈉、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氫氧化鈉、葡萄糖（glucose）及油酸聚醇山梨酯（polysorbate 80,Tween 80）均採用試藥級；蛋白腖（peptone）、胰化蛋白腖（tryptone）、酵母抽出物（yeast extract）及洋菜（agar）均採用微生物級。
2.2.18. 1N氫氧化鈉溶液之配製：
稱取氫氧化鈉
2.2.19. 稀釋液之配製：
2.2.19.1. 生理食鹽水：
取氯化鈉8.5 g，溶於蒸餾水
2.2.19.2. 磷酸鹽緩衝液（Butterfield's phosphate-buffered dilution water）：
取磷酸二氫鉀
2.2.19.3. 0.1%蛋白腖稀釋液（0.1% peptone diluent）：
取蛋白腖
2.2.20. 平板計數培養基（Plate count agar, PCA），亦稱標準方法培養基（Standard method agar）
胰化蛋白腖（tryptone）........................................................................................ 5 g
酵母抽出物（yeast extract）.............................................................................. 2.5 g
葡萄糖（glucose）................................................................................................. 1 g
洋菜（agar）........................................................................................................ 15 g
蒸餾水.............................................................................................................. 1000 mL
加熱溶解後，分裝於適當之容器中，經
2.3. 檢液之調製
2.3.1. 固態檢體：將檢體切碎混合均勻後，取
2.3.2. 粉狀、粒狀或其他易於粉碎之檢體：以已滅菌之藥勺或其他用具將檢體粉碎後，混合均勻，取
2.3.3. 液態檢體：將檢體振搖均勻混合，取
2.3.4. 冷凍檢體：須解凍者，如冷凍魚、禽畜肉、蔬果、水餃等，應在冷藏之溫度下解凍（如2～
2.3.5. 凝態及濃稠液態檢體：如布丁、煉乳、海苔醬等，經攪拌均勻後，取
2.3.6. 系列稀釋檢液：使用已滅菌之吸管，吸取上述之10倍稀釋檢液
註：1. 除肉製品使用0.1%蛋白腖稀釋液外，其他檢體以磷酸鹽緩衝液作為稀釋液，其次為生理食鹽水。
2. 檢體總量不足50 g（mL）時，應依檢體量，添加適量之稀釋液，作成10倍稀釋檢液。
3. 處理含油脂量多，不易勻散及易起泡沫之檢體時，應加入適量已滅菌之乳化劑（如Tween 80，使其於檢液中濃度為1%），並充分振搖，使之乳化。
2.4. 生菌之培養
2.4.1. 將稀釋檢液及（或）原液充分振搖，混合均勻。
2.4.2. 各吸取各稀釋檢液及（或）原液
2.4.3. 另吸取稀釋液
2.4.4. 2.4.2.節及2.4.3.節之各培養皿中倒入冷卻至45 ±
2.4.5. 將
2.5. 生菌之計算
2.5.1. 經培養後，選取25～250個菌落之兩個平板來計數，其生菌數之表示方式為CFU/g或CFU/mL。
2.5.2. 若各稀釋倍數中僅有一種稀釋倍數平板之菌落數為25～250個，則應以該稀釋倍數之兩個平板之菌落數平均值乘其稀釋倍數，即得其生菌數（附表：樣品編號1）；但若有兩種稀釋倍數之平板之菌落數在25～250個之間時，則應依下列公式計算之，但生菌數結果表示時應將該數字第三位數字四捨六入（當第三位數字為五時，遇第二位數字為奇數時進位，偶數時捨去），使其有效數為兩位。（附表：樣品編號2）。
生菌數（CFU/g或CFU/mL）＝
Aa、Ab：A稀釋倍數各平板內之菌落數。
Ba、Bb：B稀釋倍數各平板內之菌落數。
A、B：稀釋倍數。
2.5.3. 各稀釋倍數之菌落數均小於25個時，則以最低稀釋倍數之兩個平板菌落數平均值乘其稀釋倍數。並註明其為估計值（附表：樣品編號3）。
2.5.4. 平板中菌落數大於250個時，則先計數平板中菌落分佈其代表性之一部份，再計算生菌數，而以估計值表示（附表：樣品編號4）。
2.5.5. 擴散菌落，擴散菌落可分為3種形式：
(1) 鏈狀菌落，不能明顯分離，似乎由一堆細菌分裂生長而成。
(2) 細菌生長介於培養基及培養皿底部間之一層水氣中。
(3) 細菌生長於培養基邊緣或表面上之一層水氣上。
2.5.5.1. 平板內產生擴散菌落時應以下述之方法計數。（附表：樣品編號5）擴散菌落所覆蓋面積（包括被擴散菌落造成之抑制生長範圍）超過整個平板面積之1/2時或者被擴散菌落造成之抑制生長範圍超過1/4時，應不予計數，而記錄為’’擴散菌落’’。
2.5.5.2. 擴散菌落形成鏈狀時，若僅一條則應視為一個菌落，若有兩條以上存在時，應視其鏈源處之不同，分別計數之。若為彼此分開而形成大菌落時，亦應予以計數。
2.5.6. 各稀釋倍數均無菌落生長者，則生菌數應小於1乘以最低稀釋倍數並註明估計值（附表：樣品編號6）。
2.5.7. 若二重複平板之菌落數，其中一片在25～250個之間，另一片大於250個時，兩者均應計數（附表：樣品編號7）。
2.5.8. 若二稀釋倍數之菌落數，各有一片在25～250個之間，另一片大於250個或小於25個時，四片皆計數，並依
2.5.9. 當二稀釋倍數之菌落數，其中1稀釋倍數之2重複平板之菌落數均在25～250之間，另1稀釋倍數之2重複平板之菌落數，一片在25～250之間，另一片大於250個或小於25個時，四片皆計數，並依公式計算之（附表：樣品編號9及10）。
2.5.10. 確證被污染者或依其他理由認為不適當者，應不得計算之。
附表 生菌數計算舉例說明（2平板／稀釋倍數）
2.6. 檢驗流程圖
2.7. 可參考使用經確效認可之市售培養基、生化檢測套組或鑑定系統，惟檢驗結果有爭議時，應以本檢驗方法為準。
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